اهمیت شناسایی مایکوپلاسما در داروسازی
مایکوپلاسماها کوچکترین موجودات زندهای هستند که قادر به تکثیر مستقل بوده و ویژگی منحصربهفرد آنها، نبود دیواره سلولی است. همین ویژگی موجب میشود که در برابر بسیاری از آنتیبیوتیکهای متداول (مانند بتالاکتامها) مقاوم باشند و بهراحتی از فیلترهای میکروبی عبور کنند. این باکتریها قادرند بهصورت پنهان (latent infection) در محیطهای کشت سلولی رشد کرده و بدون ایجاد نشانههای ظاهری آشکار، برای مدت طولانی در خطوط سلولی باقی بمانند.
در فرآیند تولید محصولات بیولوژیک نظیر آنتیبادیهای مونوکلونال، پروتئینهای نوترکیب، واکسنها، فرآوردههای مشتق از سلولهای پستانداران یا باکتریایی و محصولات ژندرمانی، حضور مایکوپلاسما یکی از مهمترین ریسکهای آلودگی میکروبی محسوب میشود. آلودگی حتی با مقدار بسیار کم مایکوپلاسما میتواند اثرات عمیقی بر عملکرد سیستم تولید داشته باشد؛ از جمله:
- تغییر در بیان ژنها و متابولیسم سلولهای تولیدکننده،
- تغییر در گلیکوزیلاسیون و ساختار پروتئینهای بیانشده،
- کاهش بازده محصول،
- تداخل در نتایج آزمونهای کنترل کیفی مانند HCP یا بیو اسیها،
- و در نهایت، تهدید مستقیم سلامت بیمار به دلیل ورود آلودگی به فرآورده نهایی.
به دلیل این خطرات، کنترل دقیق آلودگی مایکوپلاسما از مراحل اولیه توسعه تا تولید صنعتی یک الزام قانونی است. فارماکوپههای معتبر بینالمللی از جمله USP <63>، EP 2.6.7، JP 4.4 و همچنین دستورالعملهای ICH Q5A(R2)، انجام آزمون مایکوپلاسما را پیش از رهاسازی هر دسته از محصولات بیولوژیک الزامی میدانند. مراجع نظارتی همچون FDA، EMA و WHO نیز گزارش منفی مایکوپلاسما را یکی از اسناد ضروری در مستندات ثبت و تأیید محصول میدانند.
از آنجا که روشهای سنتی مبتنی بر کشت و رشد مایکوپلاسما روی محیطهای اختصاصی بسیار زمانبر (تا 28 روز) و مستعد خطا هستند، در سالهای اخیر روشهای مولکولی مانند PCR و Real-Time PCR جایگزینی قابل اعتماد و سریع برای شناسایی این آلودگی شدهاند. این روشها با دقت بالا، حساسیت زیاد و توانایی تشخیص گونههای مختلف مایکوپلاسما، نقش کلیدی در کنترل کیفی خطوط تولید و اطمینان از ایمنی محصولات دارویی و بیولوژیک دارند.
براساس الزامات ICH Q5A، USP <63> و EP 2.6.7، انجام آزمون مایکوپلاسما یک مرحله حیاتی در کنترل کیفی محصولات بیولوژیک به شمار میآید و نتایج آن برای ورود به بازار جهانی ضروری است.
روشهای تشخیص مایکوپلاسما
شناسایی مایکوپلاسما یکی از آزمونهای حیاتی در کنترل کیفی محصولات بیولوژیک است. از آنجا که این میکروارگانیسمها بسیار کوچک، فاقد دیواره سلولی و با رشد آهسته هستند، تشخیص آنها نیازمند روشهای اختصاصی و حساس است. به طور کلی، سه گروه روش برای شناسایی آلودگی مایکوپلاسما مورد استفاده قرار میگیرد:
1. روشهای کشت و رشد (Culture-Based Methods)
این روشها بر اساس رشد مایکوپلاسما روی محیطهای اختصاصی جامد و مایع طراحی شدهاند. با مشاهده کلونیهای مشخص یا تغییرات pH در محیط، حضور مایکوپلاسما تأیید میشود.
- مزایا: مرجع و پایه بسیاری از فارماکوپهها، امکان مشاهده مستقیم ارگانیسم زنده.
- معایب: زمانبر (تا 28 روز)، نیاز به محیطهای اختصاصی و مهارت بالا، حساسیت پایین در آلودگیهای کم.
2. روشهای ایمنیشناسی (Immunological Methods)
در این گروه از روشها، شناسایی آنتیژنها یا متابولیتهای اختصاصی مایکوپلاسما با استفاده از آنتیبادیهای اختصاصی انجام میشود. آزمونهایی مانند ELISA و DNA Fluorochrome Staining در این دسته قرار میگیرند.
- مزایا: زمان کوتاهتر نسبت به کشت، مناسب برای بررسی سریع نمونهها.
- معایب: اختصاصیت پایین برای گونههای مختلف مایکوپلاسما و احتمال نتایج منفی یا مثبت کاذب.
3. روشهای مولکولی (Molecular Methods)
پیشرفتهترین و حساسترین روشهای موجود برای شناسایی مایکوپلاسما، روشهای مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) هستند. این روشها قادرند حضور حتی مقادیر بسیار ناچیز DNA مایکوپلاسما را در نمونههای سلولی، محیطهای کشت یا محصولات نهایی شناسایی کنند.
در آرک زیست آزما، دو تکنیک پیشرفته زیر برای تشخیص سریع و دقیق مایکوپلاسما بهکار گرفته میشود:
Real-Time PCR: با استفاده از فلورسانس و پایش واکنش در لحظه، امکان تشخیص سریع (در کمتر از 48 ساعت) و کمیسازی (Ct Value) وجود دارد. این روش برای پایش روتین خطوط تولید و کنترل نهایی محصول ایدهآل است.
PCR: ارزان تر از روش ریل تایم PCR بوده و وجود یا عدم وجود مایکوپلاسما را تعیین کرده اما میزانی از آلودگی به ما ارائه نمیدهد.
کاربرد آزمون مایکوپلاسما در صنعت داروسازی
مایکوپلاسماها از جمله آلودگیهای پنهان اما بسیار خطرناک در فرآیند تولید داروهای بیولوژیک هستند. برخلاف بسیاری از باکتریها، به دلیل نداشتن دیواره سلولی، تشخیص و حذف آنها با روشهای معمول استریلسازی و فیلتر کردن ممکن نیست. حضور این میکروارگانیسمها در خطوط تولید، محیطهای کشت سلولی یا حتی در مواد خام بیولوژیک، میتواند عواقب جدی بر کیفیت و ایمنی محصولات دارویی بهجا بگذارد.
در صنعت داروسازی، آزمون مایکوپلاسما نه تنها یک الزام کیفی، بلکه یک الزام قانونی و مقرراتی است. بر اساس دستورالعملهای بینالمللی نظیر ICH Q5A(R2) و فارماکوپههای USP <63>، EP 2.6.7 و JP 4.4، هیچ محصول بیولوژیکی بدون تأیید منفی مایکوپلاسما اجازه ورود به بازار ندارد. مراجع نظارتی مانند FDA، EMA و WHO بهطور ویژه بر ارائه گواهی عدم آلودگی مایکوپلاسما پیش از رهاسازی هر بچ (Batch Release) تأکید دارند.
اهمیت این آزمون در چند محور کلیدی خلاصه میشود:
1. حفظ ایمنی بیماران
محصولات بیولوژیک آلوده به مایکوپلاسما میتوانند واکنشهای شدید ایمنی، تب و حتی عفونتهای سیستمیک ایجاد کنند. انجام آزمون مایکوپلاسما تضمین میکند که فرآورده تزریقی یا درمانی از هرگونه آلودگی میکروبی خطرناک عاری است.
2. پایداری و کارایی فرآیند تولید
مایکوپلاسما میتواند بر رشد سلولهای تولیدکننده (مانند CHO، HEK293 و Hybridoma) اثر گذاشته و با تغییر در متابولیسم، بیان ژنها و مسیرهای سنتز پروتئینی، کیفیت محصول نهایی را بهطور چشمگیری کاهش دهد. کنترل منظم مایکوپلاسما در مراحل کشت سلولی، از خسارات سنگین در مقیاس صنعتی جلوگیری میکند.
3. رعایت الزامات بینالمللی و اخذ مجوز ثبت دارو
در پروندههای ثبت محصولات بیولوژیک، ارائه مستندات معتبر آزمون مایکوپلاسما از الزامات اصلی بخش Quality Dossier (Module 3) است. گزارش منفی این تست، یکی از مدارک حیاتی برای تأیید نهایی در سازمان غذا و دارو ایران و مراجع بینالمللی بهشمار میرود.
4. پیشگیری از آلودگیهای متقاطع و توقف تولید
در خطوط تولید داروهای بیولوژیک، وجود مایکوپلاسما میتواند منجر به آلودگی متقاطع در دستههای دیگر، توقف کامل خط تولید و حتی معدوم شدن بچهای تولیدشده شود. آزمونهای سریع و دقیق وابسته به PCR به واحدهای کنترل کیفیت این امکان را میدهند که در کوتاهترین زمان، تصمیمات پیشگیرانه و اصلاحی اتخاذ کنند.
در نتیجه، آزمون مایکوپلاسما یکی از حساسترین و حیاتیترین آزمونهای کنترل کیفی در صنعت دارویی و بیوتکنولوژی است.
در آرک زیست آزما، این تست با استفاده از هر دو روش Real-Time PCR و PCR ( بنا به درخواست شما ) و تحت استانداردهای بینالمللی انجام میشود تا اطمینان کامل از سلامت، پایداری و انطباق محصولات بیولوژیک با الزامات جهانی فراهم گردد.
در آرک زیست آزما، تست مایکوپلاسما با هر دو روش Real-Time PCR و PCR ارائه میشود تا مشتریان بتوانند بسته به نیاز خود (کنترل روتین یا تأیید حساس) از خدمات استفاده کنند. این رویکرد دقت، سرعت و قابلیت اطمینان بالایی در تضمین کیفیت محصولات دارویی و بیولوژیک فراهم میکند.
مزیت استفاده از Real-Time PCR نسبت به PCR معمولی در تشخیص مایکوپلاسما
در آزمونهای تشخیص مایکوپلاسما، روش PCR بهطور سنتی برای شناسایی حضور DNA باکتری استفاده میشود. با این حال، پیشرفت فناوریهای مولکولی موجب شده روش Real-Time PCR (qPCR) جایگزینی دقیقتر، سریعتر و قابل اطمینانتر برای PCR معمولی شود. هرچند هر دو روش بر پایه همان اصول تکثیر DNA عمل میکنند، اما تفاوتهای فنی و تحلیلی باعث شده Real-Time PCR به روش ترجیحی در کنترل کیفی محصولات دارویی تبدیل شود.
1. کشف و تحلیل در لحظه (Real-Time Detection)
در PCR معمولی، محصول نهایی باید پس از پایان واکنش روی ژل آگارز مشاهده شود. این مرحله نهتنها زمانبر است، بلکه به تفسیر بصری باندها وابسته است و خطای انسانی میتواند در نتیجه تأثیر بگذارد.
در مقابل، Real-Time PCR از رنگها یا پروبهای فلورسانس استفاده میکند و تکثیر DNA را در لحظه و بهصورت دیجیتال رصد میکند. به همین دلیل، نیازی به انجام الکتروفورز یا باز کردن لولهها وجود ندارد و نتیجه کاملاً دقیق و عددی ثبت میشود.
2. افزایش دقت و اختصاصیت تشخیص
در Real-Time PCR از پروبهای اختصاصی برای ژنهای ویژه مایکوپلاسما استفاده میشود (مانند 16S rRNA یا conserved genomic regions)، که باعث میشود فقط توالی هدف شناسایی شود.
در حالی که در PCR معمولی ممکن است باندهای غیراختصاصی یا دایمر پرایمرها (Primer Dimer) مشاهده شود و نتیجه را مبهم کند.
3. حساسیت بالاتر در تشخیص مقادیر اندک DNA
Real-Time PCR قادر است وجود حتی چند کپی از DNA مایکوپلاسما را در نمونه شناسایی کند.
این ویژگی برای فرآوردههای بیولوژیکی با آلودگیهای بسیار پایین اهمیت زیادی دارد، زیرا حتی مقادیر جزئی مایکوپلاسما میتوانند بر خطوط سلولی یا کیفیت محصول اثر منفی بگذارند.
4. امکان کمیسازی دقیق (Quantification)
PCR معمولی فقط نتیجهی کیفی «مثبت» یا «منفی» ارائه میدهد.
اما Real-Time PCR مقدار DNA هدف را از طریق مقدار Ct (Cycle Threshold) محاسبه میکند. این اطلاعات کمی میتواند در پایش میزان آلودگی، ارزیابی اثربخشی فرآیندهای پاکسازی و تأیید پاک بودن خطوط تولید استفاده شود.
5. سرعت بالاتر و اتوماسیون فرآیند
Real-Time PCR از آغاز واکنش تا نتیجه نهایی معمولاً کمتر از ۲ ساعت زمان نیاز دارد و تمام مراحل بهصورت بسته در دستگاه انجام میشود. در حالی که PCR معمولی علاوه بر زمان واکنش، به مراحل الکتروفورز و آنالیز دستی نیاز دارد.
این ویژگی باعث میشود Real-Time PCR برای کنترل کیفی سریع پیش از رهاسازی محصول (Batch Release) بسیار کارآمد باشد.
6. کاهش نیاز به تفسیر ذهنی و افزایش تکرارپذیری
در PCR معمولی، تشخیص باندها روی ژل ممکن است توسط افراد مختلف متفاوت تفسیر شود، خصوصاً در نمونههای با باندهای ضعیف.
در Real-Time PCR، دادهها بهصورت نرمافزاری و عددی (Ct values, amplification curves) ثبت میشوند، که باعث افزایش تکرارپذیری و قابلیت اعتبارسنجی (Validation) میشود.
7. انطباق با الزامات فارماکوپه و مراجع بینالمللی
اگرچه فارماکوپهها الزام صریحی برای استفاده از Real-Time PCR ندارند، اما این روش به عنوان روش تأییدشده (Validated Alternative Method) در ICH Q5A(R2)، USP <63> و EP 2.6.7 مورد قبول است.
به همین دلیل، بیشتر شرکتهای داروسازی و مراکز بینالمللی از Real-Time PCR به عنوان روش استاندارد برای گزارش نهایی آلودگی مایکوپلاسما استفاده میکنند.
