کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در حال حاضر یکی از قدرتمندترین ابزارها در آنالیزهای دستگاهی است. HPLC این توانایی را دارد که ترکیبات موجود در هر نمونه ای که بتواند در مایع حل شود را جداسازی، اندازه گیری و شناسایی کند. امروزه، ترکیباتی در غلظتهای کمتر از ppt به راحتی با روش HPLC قابل شناسایی هستند. HPLC را می توان تقریباً برای هر نمونه ای مانند داروها، مواد غذایی، مواد غذایی، آرایشی و بهداشتی، نمونه های پزشکی قانونی و مواد شیمیایی صنعتی به کار برد.
در ادامه با جزئیات بیشتری در مورد تست HPLC آشنا خواهیم شد.
شرکت آرک زیست آزما به عنوان یکی از با سابقه ترین آزمایشگاه های کنترل کیفی دارو و آزمایشگاه همکار سازمان غذا و دارو آماده ارائه خدمات تست HPLC به شرکت های تولید کننده، مراکز تحقیقاتی و پژوهشگران عزیز میباشد.
کروماتوگرافی چیست
کروماتوگرافی مایع – به انگلیسی Liquid chromatography (LC) – اولین بار در اوایل 1900 میلادی توسط گیاه شناس روسی Mikhail S. Tswett ابداع شد. این دانشمند اجزای عصاره برگ گیاهان را توسط یک حلال در ستونی پک شده با گچ و آلومینا جداسازی کرد. کروماتوگرافی نامی است که Tswett روی این تکنیک قرار داد که نشان دهنده گرادیان رنگی ای بود که در آزمایش خود مشاهده کرده بود.
خلاصه ترین تعریف از کروماتوگرافی شاید این باشد که در سیستم کروماتوگرافی نمونه مجهول یا میکس ما در ستونی حرکت خواهد کرد که تمایل اجزای مختلف ترکیب مورد مطالعه ما به ذرات ستون متفاوت بوده و این جاذبه متفاوت باعث میشود که حرکت اجزای مختلف ترکیب در ستون با سرعت متفاوتی انجام شود. مهمترین نکته در فرایند کروماتوگرافی حرکت بر اساس میزان تمایل به اتصال ذرات ستون بوده و انواع مخلف کروماتوگرافی بر همین اساس طراحی شده است.
کروماتوگرافی مایع میتواند به صورت مسطح ( planar )، مانند کروماتوگرافی کاغذی و کروماتوگرافی لایه نازک یا Thin Layer Chromatography (TLC) و یا به صورت ستونی انجام شود.
کروماتوگرافی TLC
در کروماتوگرافی لایه نازک یا TLC، نمونه بر روی یک لایه نازک از فاز ثابت که بر روی سطح یک صفحه شیشه ای ثابت شده، به صورت لکه ای قرار داده میشود. پس از فیکس شدن لکه روی لایه نازک، لبه پایین صفحه در یک حلال قرار می گیرد. جریان با عمل مویرگی در فاز ثابت کروماتوگرافی ایجاد شده و حلال در لایه نازک پیش روی کرده و همراه خود ذرات نمونه را حرکت میدهد. این روش کروماتوگرافی لایه نازک یا TLC نامیده می شود.
کروماتوگرافی کاغذی
در کروماتوگرافی کاغذی نمونه ها روی کاغذ [فاز ثابت] لکه می شوند. سپس حلال [فاز متحرک] به مرکز نقطه اضافه می شود تا یک جریان شعاعی به سمت بیرون ایجاد شود. البته کروماتوگرافی کاغذی را میتوانیم کلاسیک به روشی مشابه TLC با جریان خطی و حرکت مایع بر اساس خاصیت موئینگی انجام دهیدم.
کروماتوگرافی ستونی
کروماتوگرافی ستونی قوی ترین روش کروماتوگرافی کلاسیک است. در این روش نمونه از یک ستون یا یک دستگاه کارتریج حاوی ذرات با جنس مشخص [فاز ثابت] عبور می کند. به این ذرات مواد بسته بندی کروماتوگرافی – chromatographic packing material – می گویند. حلال [فاز متحرک] در ستون دستگاه جریان پیدا کرده و گرادیانی از نمونه در ستون ایجاد میشود. بسته به نوع کار و هدف جداسازی این آزمایش میتواند به صورت های مختلفی طراحی شود. یکی از کاربردهای کروماتوگرافی ستونی جداسازی نمونه است که معروف ترین روش مورد استفاده استخراج فاز جامد یا SPE است.
استخراج فاز جامد – به انگلیسی solid-phase extraction [SPE] – یکی از انواع کروماتوگرافی ستونی است. در استخراج فاز جامد [SPE]، نمونه بر روی کارتریج بارگذاری می شود و جریان حلال در ستون ایجاد میشود. در این روش از حلال های مختلفی استفاده میشود که هر حلال میتواند تنها بخشی از نمونه را در خود حل کرده و از ستون خارج کند. در این روش یک حلال بعد از شستشو مابقی مواد روی ستون را باقی میگذارد و تنها موادی که با حضو حلال از ستون جدا میشوند با حلال همراه میشوند.
روش HPLC یا کروماتوگرافی مایع با فشار بالا
اولین باری که کلمه HPLC را در کتاب های علمی مشاهده کردم، اولین جمله ای که به ذهن من خطور کرد high pressure liquid chromatography بود. البته شما به خوبی میدانید که P مخففی از Prefromance است اما شاید این نکته را ندانید که اولین بار P مخفف Pressure بوده است.
مخفف HPLC که توسط پروفسور Csaba Horváth در مقاله ای در سال 1970 ابداع شد، در اصل نشان دهنده این واقعیت است که فشار بالا برای تولید جریان مورد نیاز برای کروماتوگرافی مایع در ستون های بسته بندی شده استفاده می شود. در ابتدا، پمپ ها تنها دارای قابلیت فشار 500 psi یا 35 بار بودند. این روش کروماتوگرافی high pressure liquid chromatography یا HPLC نام داشت. اوایل دهه 1970 تکنولوژی HPLC بهینه سازی شد که جهشی بزرگ در این تکنیک به شمار می رفت. با این تغییرات فشار در HPLC به بالاتر از 6000 PSI یا 400 بار رفت و اینجکتور، ستونها و دکتورها بهینه سازی شدند. در عمل HPLC در اواخر 1970 به صورت همگانی در آمد و با تمام این پیشرفت ها نام آن همواره HPLC بود اما از سال 1970 به بعد به آن high performance liquid chromatography گفته شد.
HPLC چگونه کار میکند ؟
HPLC از یک مخزن، پمپ، محل ورود یا اینجکتور، ستون و در نهایت شناساگر یا دتکتور تشکیل شده است. مخزن حلال یا فاز متحرک را در خود نگهداری میکند. یک پمپ فشار بالا یا به عبارت دیگر سیستم مدیریت حلال، برای تولید و اندازه گیری نرخ جریان مشخص فاز متحرک استفاده می شود. ورودی یا اینجکتور که ممکن است به سیستم های اتوماتیک هم مجهز باشد، میتواند نمونه را به جریان فاز متحرک وارد کند تا نمونه به همراه فاز ثابت به سمت ستون حرکت کند. ستون حاوی مواد بسته بندی کروماتوگرافی مورد نیاز برای انجام جداسازی است. انواع ستون های کروماتوگرافی فاز های مختلفی را دارا هستند. این ماده بسته بندی را فاز ثابت می نامند زیرا توسط سخت افزار ستون در جای خود ثابت می شود. آشکارساز برای دیدن پیک های حاصل از ترکیب جدا شده در حین خروج از ستون HPLC استفاده میشود. فاز متحرک از آشکارساز خارج می شود و می تواند به زباله فرستاده شود، یا در صورت تمایل جمع آوری شود. هنگامی که فاز متحرک حاوی یک نوار ترکیبی جدا شده است، HPLC توانایی جمع آوری این بخش از مایع شستشوی حاوی آن ترکیب خالص شده را برای مطالعه بیشتر فراهم می کند.
آشکارساز به ایستگاه داده کامپیوتری – یک PC معمولی یا یک بخش هوشمند که به صورت داخلی در خود دستگاه مستقر شده – متصل می شود. کامپیوتر متصل به سیستم HPLC میتواند سیگنال دریافت شده از دکتور را روی صفحه نمایش خود به صورت یک پیک کروماتوگرام با مشخصه های قابل ارزیابی نمایش دهد. از آنجایی که ویژگی های ترکیب نمونه می تواند بسیار متفاوت باشد، انواع مختلفی از آشکارسازها توسعه یافته اند. به عنوان مثال، اگر یک ترکیب بتواند نور ماوراء بنفش را جذب کند، از یک آشکارساز جذب کننده UV استفاده می شود. اگر ترکیب فلورسانس شود، از آشکارساز فلورسانس استفاده می شود. اگر ترکیب هیچ یک از این ویژگی ها را نداشته باشد، از یک نوع آشکارساز جهانی تر مانند آشکارساز تبخیری-پراکنده نور [ELSD] استفاده می شود. قدرتمندترین روش استفاده از آشکارسازهای متعدد به صورت سری است. به عنوان مثال، یک آشکارساز UV و/یا ELSD ممکن است در ترکیب با یک طیف سنج جرمی [MS] برای تجزیه و تحلیل نتایج جداسازی کروماتوگرافی استفاده شود. این از طریق یک تزریق اطلاعات جامع تری در مورد یک آنالیت فراهم می کند. عمل اتصال طیف سنج جرمی به سیستم HPLC را LC/MS می نامند.
عملکرد دستگاه HPLC
یک راه ساده برای درک چگونگی دستیابی به جداسازی ترکیبات موجود در یک نمونه در تست HPLC، مشاهده نمودار در شکل زیر است.
فاز متحرک از سمت چپ وارد ستون می شود، از بستر ذرات می گذرد و از سمت راست خارج می شود. جهت جریان با فلش های سبز نشان داده می شود. ابتدا تصویر بالا را در نظر بگیرید. این نشان دهنده ستون در زمان صفر [لحظه تزریق] است، زمانی که نمونه وارد ستون می شود و شروع به تشکیل یک نوار می کند. نمونه ای که در اینجا نشان داده شده است، مخلوطی از رنگ های زرد، قرمز و آبی است که در ورودی ستون به صورت یک نوار مشکی منفرد ظاهر می شود. [در واقع، این نمونه می تواند هر چیزی باشد که می تواند در یک حلال حل شود. معمولاً ترکیبات بی رنگ و دیواره ستون مات هستند، بنابراین ما به یک آشکارساز نیاز داریم تا ترکیبات جدا شده را هنگام شستشو ببینیم.]
پس از چند دقیقه [تصویر پایین]، که در طی آن فاز متحرک به طور پیوسته و پیوسته از کنار ذرات مواد بستهبندی جریان مییابد، میتوان دید که تک تک رنگها در نوارهای جداگانه با سرعتهای متفاوت حرکت کردهاند. این به این دلیل است که بین فاز متحرک و فاز ثابت برای جذب هر یک از رنگ ها یا آنالیت ها رقابت وجود دارد. توجه داشته باشید که نوار رنگ زرد سریعترین حرکت را دارد و در شرف خروج از ستون است. رنگ زرد بیشتر از سایر رنگ ها فاز متحرک را می پسندد. بنابراین، با سرعت بیشتری حرکت می کند، نزدیکتر به فاز متحرک. نوار رنگ آبی مواد بسته بندی را بیشتر از فاز متحرک دوست دارد. جاذبه قوی تر آن به ذرات باعث می شود که به طور قابل توجهی کندتر حرکت کند. به عبارت دیگر، بیشترین ترکیب را در این مخلوط نمونه حفظ می کند. نوار رنگ قرمز جاذبه متوسطی برای فاز متحرک دارد و بنابراین با سرعت متوسطی در ستون حرکت می کند. از آنجایی که هر نوار رنگی با سرعت متفاوتی حرکت میکند، میتوانیم آن را از نظر کروماتوگرافی جدا کنیم.
دکتور یا آشکارساز در HPLC
همانطور که نوارهای رنگ جدا شده از ستون خارج می شوند، بلافاصله وارد آشکارساز می شوند. آشکارساز حاوی یک سلول جریان است که هر باند ترکیبی جدا شده را در پس زمینه فاز متحرک می بیند . [در واقع، محلولهای بسیاری از ترکیبات در غلظتهای تحلیلی HPLC معمولی بیرنگ هستند.] یک آشکارساز مناسب این توانایی را دارد که حضور یک ترکیب را حس کرده و سیگنال الکتریکی مربوطه را به ایستگاه دادههای کامپیوتری ارسال کند. بسته به ویژگی ها و غلظت ترکیباتی که نیاز به جداسازی و تجزیه و تحلیل دارند، انتخابی از میان انواع مختلف آشکارسازها انجام می شود.
کروماتوگرام HPLC
کروماتوگرام نمایشی از جداسازی است که در سیستم HPLC رخ داده است. مجموعهای از قلههایی که از یک خط پایه بالا میآیند روی یک محور زمانی رسم میشوند. هر پیک نشان دهنده پاسخ آشکارساز برای یک ترکیب متفاوت است. کروماتوگرام توسط ایستگاه داده رایانه ترسیم می شود
وقتی یک ماده به طور کامل از سلول جریان آشکارساز عبور کند، سیگنال الکتریکی حاصل از آن به ایستگاه داده کامپیوتر ارسال شده و کروماتوگرام حاصل روی صفحه ظاهر می شود. توجه داشته باشید که کروماتوگرام از زمانی که نمونه برای اولین بار تزریق شد شروع می شود و به صورت یک خط مستقیم در نزدیکی پایین صفحه شروع می شود. این خط پایه نامیده می شود. این فاز متحرک خالص را نشان می دهد که در طول زمان از سلول جریان عبور می کند. همانطور که آنالیت از سلول جریان عبور می کند، سیگنال قوی تری به کامپیوتر ارسال می شود. منحنی خط، ابتدا به سمت بالا و سپس به سمت پایین، متناسب با غلظت نمونه در باند نمونه است. این یک پیک در کروماتوگرام ایجاد می کند. پس از اینکه آنالیت به طور کامل از سلول آشکارساز خارج شد، سطح سیگنال به خط پایه باز می گردد. سلول جریان اکنون یک بار دیگر فقط فاز متحرک خالص در خود دارد. در شکل بالا از آنجایی که نوار زرد سریعترین حرکت را دارد و ابتدا از ستون بیرون میآید، اولین قلهای است که کشیده میشود.
کمی بعد نوار بعدی به سلول جریان می رسد. هنگامی که نوار بعدی ابتدا وارد سلول می شود، سیگنال از خط پایه بالا می رود و قله نشان دهنده آن شروع به رسم شدن می کند. در شکل بالا، نوار قرمز به طور کامل از سلول جریان عبور نکرده است. نمودار نشان می دهد که اگر در این لحظه روند را متوقف کنیم، نوار قرمز و قله قرمز چگونه به نظر می رسند. از آنجایی که بیشتر نوار قرمز از سلول عبور کرده است، همانطور که توسط خط ثابت نشان داده شده است، بیشتر قله رسم شده است. اگر بتوانیم دوباره راه اندازی کنیم، نوار قرمز به طور کامل از سلول جریان عبور می کند و قله قرمز تکمیل می شود [خط نقطه چین]. نوار آبی که به شدت حفظ می شود، با کمترین سرعت حرکت می کند و بعد از نوار قرمز شسته می شود. خط نقطه چین به شما نشان میدهد که اگر ما اجازه میدهیم که اجرا تا پایان خود ادامه یابد، کروماتوگرام تکمیلشده چگونه ظاهر میشود. جالب است بدانید که پهنای قله آبی وسیعترین خواهد بود، زیرا پهنای نوار آنالیت آبی، در حالی که باریکترین روی ستون است، با خروج از ستون، وسیعترین میشود. این به این دلیل است که آهسته تر از طریق بستر مواد بسته بندی کروماتوگرافی حرکت می کند و برای شستشوی کامل به زمان بیشتری [و حجم فاز متحرک] نیاز دارد. از آنجایی که فاز متحرک به طور پیوسته با سرعت ثابتی جریان دارد، این بدان معناست که نوار آبی پهن شده و رقیقتر میشود. از آنجایی که آشکارساز متناسب با غلظت نوار پاسخ می دهد، قله آبی از نظر ارتفاع کمتر، اما از نظر عرض بزرگتر است.
شناسایی و اندازه گیری آنالیت در تست HPLC
در تصویر بالا سه ترکیب با سه پیک مختلف از یکدیگر جداسازی شده اند. هر ترکیب در زمان مشخصی هر کدام در یک مکان خاص شستشو میشوند که با زمان سپری شده بین لحظه تزریق [زمان صفر] و زمانی که حداکثر حداکثر شسته میشود اندازهگیری میشود. زمان خروج یا زمان ماند یا retention time که به اختصار tR نیز نامیده میشود و مقایسه آن با نمونه استاندارد در شرایط کروماتوگرافی مشابه میتوانیم نوع ماده مورد نظر را مشخص کنیم.
در کروماتوگرام نشان داده شده در شکل، تکنسین انجام دهنده تست بر اساس استاندرد می دانسته است که، تحت این شرایط سیستم LC، آنالیت – در این نمونه آکریل آمید- در 2.85 دقیقه [tR] از ستون شسته می شود. هر زمان که یک نمونه جدید که اتفاقاً حاوی آکریل آمید بود، تحت شرایط یکسان به سیستم LC تزریق شود، یک پیک در 2.85 دقیقه وجود خواهد داشت.
هنگامی که هویت مشخص شد، اطلاعات مهم بعدی این است که چه مقدار از هر ترکیب در نمونه وجود داشته است. کروماتوگرام و داده های مربوط به آشکارساز به ما کمک می کند غلظت هر ترکیب را محاسبه کنیم. آشکارساز اساساً به غلظت نوار ترکیبی هنگام عبور از سلول جریان پاسخ می دهد. هرچه غلظت آن بیشتر باشد، سیگنال قوی تر است. این به عنوان یک ارتفاع قله بیشتر از خط پایه – Base Line – دیده می شود.
در شکل بالا، کروماتوگرامهای نمونههای A و B، در مقیاس زمانی یکسان، روی هم چیده شدهاند. حجم مشابهی از نمونه در هر دو اجرا تزریق شد. هر دو کروماتوگرام یک پیک را در زمان ماند [tR] 2.85 دقیقه نشان میدهند که نشان میدهد هر نمونه حاوی آکریل آمید است. با این حال، نمونه A پیک بسیار بزرگتری را برای آکریل آمید نشان می دهد. مساحت زیر یک پیک معیاری از غلظت ترکیب مورد آزمایش ماست. این مقدار مساحت به طور خودکار توسط نرم افزار کامپیوتری محاسبه می شود. در این مثال، پیک آکریل آمید در نمونه A 10 برابر مساحت نمونه B است. با استفاده از استانداردهای مرجع، می توان مشخص کرد که نمونه A حاوی 10 پیکوگرم آکریل آمید است که ده برابر مقدار نمونه B است. توجه داشته باشید که پیک دیگری وجود دارد که در هر دو نمونه در 1.8 دقیقه شسته می شود. از آنجایی که تعداد مساحت این پیک در هر دو نمونه تقریباً یکسان است، این ترکیب ناشناخته ممکن است غلظت یکسانی در هر دو نمونه داشته باشد.
