در سیستم HPLC دو نوع استاندارد استفاده از حلال وجود دارد. یکی روش ایزوکراتیک ( Isocratic ) و دیگری روش گرادیان. در این نوشته در مورد مفهوم ایزوکراتیک و گرادیان صحبت کرده و کاربردهای هریک را بررسی میکنیم.
فاز متحرک در HPLC
در تست HPLC فاز متحرک از منبع با استفاده از پمپ حرکت کرده و به همراه خود آنالیت ای که از اینجکتور وارد میشود را از بین اجزای فاز ثابت حرکت میدهد. اجزای مختلف آنالیت تمایل اتصالی متفاوتی به اجزای ستون داشته و به همین دلیل در زمان عبور از ستون اجزا از یکدیگر جدا میشود. اساس روش کروماتوگرافی همین چند جمله ساده است که در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، سرعت و کیفیت جداسازی به واسطه تکنولوژی به کار رفته در فرایند به طرز شگفت انگیزی بالا رفته است و همین چند جمله ساده اساس بسیاری از آزمون های کنترل کیفی و تحقیقاتی در صنایع مختلف شده است.
HPLC به روش ایزوکراتیک
اگز فاز متحرک استفاده شده در تست HPLC در طول فرایند کروماتوگرافی ثابت و بدون تغییر باشد به این روش کروماتوگرافی، کروماتوگرافی ایزوکراتیک Isocratic گفته میشود. در این حالت تنها زمان و فشار حرکت فاز متحرک است که اجزای آنالیت را به سمت دتکتور حرکت میدهد.
HPLC گرادیان
همانطور که از نام HPLC گرادیان پیداست، در این روش ترکیب فاز متحرک در طول جداسازی تغییر می کند. این حالت برای نمونه هایی مفید است که حاوی ترکیباتی هستند که طیف وسیعی از قطبیت کروماتوگرافی را در بر می گیرند و برخی از اجزای آنالیت تمایل بسیار شدیدی به ستون دارند که به سادگی و با فاز متحرک اولیه قابل جداشدن نیستند. در این حالت با تعویض حلال به صورت گرادیان، قدرت شستشوی فاز متحرک به مرور افزایش پیدا میکند تا این اجزا از ستون جداشده و به سمت دتکتور حرکت کنند.
در ساده ترین حالت، که در شکل بالا نشان داده شده است، دو بطری حلال و دو پمپ وجود دارد. سرعت هر پمپ توسط کنترلگر گرادیان مدیریت می شود تا مقدار بیشتری از حلال را در طول جداسازی تحویل دهد. این دو جریان در میکسر ترکیب می شوند تا ترکیب فاز متحرک واقعی را ایجاد کنند که در طول زمان به ستون تحویل داده می شود. در ابتدا، فاز متحرک حاوی نسبت بیشتری از حلال ضعیف تر است. با گذشت زمان، نسبت حلال قوی تر طبق یک جدول زمانی از پیش تعیین شده افزایش می یابد. توجه داشته باشید که در شکل ، میکسر در پایین دست پمپ ها قرار دارد. بنابراین گرادیان تحت فشار بالا ایجاد می شود.
گرادیان با فشار پایین
اگر در HPLC گرادیان پمپ قبل از میکسر قرار داشته باشد، میکسر دو جریان پرفشار حلال را دریافت کرده و آنها را تنظیم میکند. در این حالت گرادیان در فشار بالا ایجاد میشود. این حالت حداکثر میتواند با دو حلال انجام شود. اما در گرادیان با فشار پایین، میکسر قبل از پمپ قرار دارد و میتواند تعداد زیادی از انواع حلال را با یکدیگر ترکیب کند. در شکل بالا یک شیر تناسب گرادیان از بین چهار بطری حلال انتخاب می شود و قدرت فاز متحرک را در طول زمان تغییر می دهد.
