در تکنیک HPLC جداسازی بر مبنای قطبیت انجام میشود. قطبیت یا همان آب دوستی یا آب گریزی یکی از مشخصه های فیزیکوشیمیایی ترکیبات آلی است که این ترکیبات بر اساس این تعریف به دو دسته قطبی و غیر قطبی تقسیم میشوند. تکنیک کروماتوگرافی کلاسیک نیز قطبیت عامل اصلی جداسازی است که اگر فاز ثابت قطبی باشد باشد به آن فاز نرمال و در صورتی که فاز ثابت غیر قطبی باشد به آن کروماتوگرافی فاز معکوس گفته میشود.
جداسازی بر اساس قطبیت
ساختار، فعالیت و ویژگی های فیزیکوشیمیایی یک مولکول با آرایش اتم های تشکیل دهنده آن و پیوندهای بین آنها تعیین می شود. در یک مولکول، آرایش خاصی از اتم های خاص که مسئول خواص ویژه و واکنش های شیمیایی قابل پیش بینی است، گروه عاملی نامیده می شود. این ساختار اغلب قطبی یا غیرقطبی بودن مولکول را تعیین می کند. قطبیت یکی از ویژگی‌های مهم ترکیبات آلی است که بر این اساس ترکیبات آلی به دو گروه قطبی یا آب دوست و غیر قطبی یا آب گریز طبقه بندی میشوند.
بر اساس ساختار و جایگاه گروه عاملی، ترکیبات مختلف شدت قطبیت متفاوتی دارند و اساس جداسازی در کروماتوگرافی کلاسیک نیز تفاوت در میزان قطبیت مولکول ها است.
آب یک مولکول کوچک با قطبیت بالا است. بنزن که یک هیدروکربن آروماتیک است، یک مولکول غیر قطبی محسوب میشود. مولکول های با قطبیت مشابه، یکدیگر را جذب میکنند و هرچه قطبیت مولکول ها با یکدیگر متفاوت باشد میزان جاذبه بین آنها کمتر شده و در نهایت دو مولکول با قطبیت متضاد یکدیگر را دفع میکنند. این اصل ساده اساس تکنیک کروماتوگرافی و HPLC وابسته به قطبیت یا است.
برای درک بهتر قطبیت به ترکیب آب و روغن فکر کنید. ترکیب روغن غیر قطبی و آب قطبی نه تنها امکان پذیر نیست بلکه ایندو به شدت یکدیگر را دفع میکنند و یک قطره آب در روغن یا یک قطره روغن در آب حالت منزوی و جدگانه به خود خواهد گرفت. نکته جالب اینجاست که در محلول آب و روغن، مولکول های با قطبیت یکسان سریعا به سمت یکدیگر جذب شده و قطره های بزرگ را تشکیل میدهند.
نکته مهم در مبحث کروماتوگرافی وابسته به قطبیت این است که دو قطب مشابه یکدیگر را جذب میکنند. این دقیقا بر خلاف جاذبه الکترومغناطیس است که مولکول های با بار مشابه یکدیگر را دفع میکنند.
وقتی در فاز ثابت کروماتوگرافی یک ترکیب قطبی قرار داده میشود، هر ترکیب قطبی بنا بر میزان جذب آن به فاز ثابت در ستون با سرعت کم حرکت میکند. در مقابل ترکیبات غیر قطبی تمایلی به اتصال به ستون نداشته و همراه با فاز متحرک با سرعت از ستون خارج میشوند. در این شرایط با حرکت فاز متحرک و تغییراتی که در آن ایجاد میشود میتوانیم ترکیبات را به ترتیب تمایل اتصال آنها به فاز ثابت ستون جداسازی کنیم.
انتخاب فاز متحرک در HPLC
انواع مختلف فاز متحرک با میزان متفاوتی از قطبیت در HPLC استفاده میشوند. یک دیاگرام خیلی ساده که میتواند ما را در انتخاب فاز متحرک مناسب کمک کند، تصویر زیر است. در این تصویر محلول های مختلف مناسب برای استفاده به عنوان فاز متحرک در HPLC به ترتیب قطبیت معرفی شده اند :
در طراحی آزمایش HPLC بایستی رقابت در جذب بین فاز ثابت و متحرک ایجاد شود. پس انتخاب فاز متحرک مناسب اهمیت زیادی در فرایند تفکیک در HPLC دارد. مقیاسی مانند آنچه در شکل بالا نشان داده شده است، که بر روی آن برخی از حلال های رایج به ترتیب قطبیت کروماتوگرافی نسبی قرار می گیرند، سری eluotropic نامیده می شود.
فاز ثابت در HPLC
فاز ثابت یا همان ستون جداسازی نیز اهمیت زیادی در فرایند HPLC دارد. فازهای ثابت نیز همانند فاز متحرک از نظر میزان قطبیت متفاوت بوده و همانند فاز متحرک قابل رتبه بندی هستند. سیلکیا با زنجیره اسیدی سیلانول یکی از قطبی ترین فازهای ثابت در کروماتوگرافی HPLC است. البته با اتصال زنجیره های با قطبیت کمتر به سیلیکا میتوان میزان قطبیت آن را تغییر داد. به همین علت سیلیکا یکی از پر استفاده ترین فازهای ثابت در HPLC است که بسته به نوع گروه عاملی متصل به آن میزان قطبیت متفاوتی از خود نشان میدهد.
میزان قطبیت نمونه های مورد آزمایش
تا اینجا در مورد قطبیت در فاز ثابت HPLC و فاز متحرک HPLC صحبت کردیم. اما هدف اصلی تفکیک ترکیبات پیچیده بود و به همین دلیل اطلاع از میزان قطبیت یک ماده شیمیایی به ما کمک زیادی در طراحی آزمون HPLC خواهد داشت. پس از در نظر گرفتن قطبیت هر دو فاز، سپس، برای یک فاز ثابت معین، کروماتوگراف باید فاز متحرکی را انتخاب کند که در آن آنالیت های مورد نظر حفظ شوند، اما نه آنقدر قوی که نتوان آنها را شستشو داد.
در میان حلال‌هایی با قدرت مشابه، کروماتوگراف در نظر می‌گیرد که کدام ترکیب فاز میتواند به بهترین وجه از تفاوت‌های ظریف‌تر در قطبیت و حلالیت آنالیت برای به حداکثر رساندن انتخاب‌پذیری سیستم کروماتوگرافی استفاده کند. مانند، مانند را جذب می کند، اما، همانطور که احتمالاً از بحث تاکنون تصور می کنید، ایجاد جدایی بر اساس قطبیت مستلزم دانش نمونه و تجربه با انواع مختلف آنالیت ها و حالت های نگهداری است. به طور خلاصه، کروماتوگراف بهترین ترکیب فاز متحرک و فاز ثابت ذره با قطبیت های مناسب را انتخاب می کند. سپس، همانطور که آنالیت های نمونه در ستون حرکت می کنند، قانون مانند جذب مانند تعیین می کند که کدام آنالیت کند می شود و کدام آنالیت با سرعت بیشتری پیش می رود.
