آلودگی میکروبی یکی از مشکلات مهم در فرایند تولید محصولات دارویی، آرایشی و بهداشتی است. میکروب‌ها میتوانند با تجزیه مواد موثره دارویی و یا افزودنی‌ها موجب فساد و از بین رفتن تاثیرگذاری، پایداری و یا کیفیت ترکیب دارویی شوند. همچنین حضور عوامل میکروبی بیماری زا میتواند یک تهدید جدی برای سلامت مصرف کنندگان فراورده باشد بویژه اینکه بسیاری از داروها برای افراد بیمار و در معرض خطر طراحی میشوند و ورود پاتوژن هرچند اندک به بدن فرد در معرض خطر می تواند مشکلات بسیار جدی را ایجاد کند.
اگرچه ممکن است برای شما تصور یک داروی آلوده به میکروب پاتوژن کمی سخت باشد، اما در تاریخچه صنعت دارویی، شاهد گزارش هایی از آلودگی میکروبی دارو که موجب ایجاد عفونت به باکتری هایی مانند Pseudomonas و Klebsiella شده است را شاهد هستیم. در حدی که در گزارش مستندی از FDA، در سالهای 2012 تا 2019، 77 درصد موارد ریکال دارویی برای داروهای غیر استریل و 87 درصد موارد ریکال در داروهای استریل به علت آلودگی میکروبی بوده است.
متداول ترین عامل آلودگی میکروبی فراورده‌های دارویی باکتریها هستند. حضور باکتری گرم مثبت در فراورده دارویی عمدتا نشان دهنده دخالت انسانی در فرایند تولید بوده و حضور باکتری های گرم منفی نشان دهنده عدم کنترل فرآیند در محیط تولید بخصوص سیستم آب و مواد اولیه دارویی است. باکتری های گرم منفی میله ای متداول ترین عوامل شناسایی شده در فراورده های دارویی غیر استریل هستند.
برای شناسایی آلودگی میکروبی در فرآورده دارویی میتوان از تست های روتین مانند روش های کشت میکروبی و آزمون های میکروبی متداول برای شناسایی میکروارگانیسم ها استفاده کرد که این روش ها ممکن است به صورت سنتی و یا با استفاده از کیت های شناسایی مانند کیت API به کار گرفته میشوند.
علاوه بر این امروزه روش های جدیدی بر مبنای روش های مولکولی مانند PCR و توالی یابی نیز پایه گذاری شده است که در این سیستم با دقت بسیار بالا میکروارگانیسم آلوده کننده شناسایی میشود. مبنای این شناسایی توالی های حفاظت شده و اختصاصی میکروارگانیسم ها مانند RNA های ریبوزومی مانند 16S rRNA هستند.
کشت میکروبی فراورده دارویی
اولین مرحله از تشخیص آلودگی، اثبات آلودگی فراورده به میکروارگانیسم است و متداول ترین راه برای اثبات آلودگی کشت است. کشت میکروبی بایستی در محیط های استاندارد کشت باکتریایی و قارچی انجام شده و در فرایند کشت بایستی به خصوصیات مهارکنندگی رشد ترکیب دارویی بایستی توجه داشت، زیرا خاصیت باکتریواستاتیک بودن یک ترکیب دارویی نمیتواند دلیلی برای عدم آلودگی ترکیب به یک عامل پاتوژن باشد.
کارشناسان کنترل کیفی میکروبی شرکت آرک زیست آزما با توجه به سابقه بالای مطالعات میکروبی فراورده دارویی بیولوژیک در این آزمایشگاه، کاملا با یک فرآورده دارویی آشنایی کامل داشته و آزمایشات کشت میکروبی دارو را بر اساس خصوصیات داروی مورد مطالعه و بر اساس استانداردهای دارویی جهانی انجام میدهند.
شناسایی میکروارگانیسم آلوده کننده به روش بیوشیمیایی
در اولین مرحله بایستی نوع میکروارگانیسم مشخص شود. اگر میکروارگانیسم مربوط به دسته باکتری ها بود بایستی از فلوچارت شناسایی باکتری ها استفاده شود. اولین قدم و متداول ترین روش شناسایی باکتریها رنگ آمیزی گرم است که در این روش دسته بندی اصلی باکتری مورد مطالعه و شکل ظاهری باکتری مورد ارزیابی قرار میگیرد.
بر اساس راهنمای شناسایی میکروبی برگی ” Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology ” مراحل بعدی تست های شناسایی قابل انجام هستند. به عنوان مثال در مورد باکتری های گرم مثبت کوکسی، رشد در محیط مانیتول سالت آگار (MSA) ، تست های کاتالاز، DNAse، همولیز خون، اوره آز و حساسیت به نووبیوسین از تست هایی هستند که در مورد این دسته از باکتری ها مورد استفاده قرار میگیرند.
برای باسیل های گرم مثبت تست هایی مانند هیدرولیز نشاسته و تست های کاتالاز و Voges Proskauer انجام میشود و ممکن است روش های رنگ آمیزی اسپور برای این دسته از باکتری ها مورد استفاده قرار گیرد.
گرم منفی ها را می توانیم بر اساس رشد روی محیط مک کانکی و ستریماید آگار مورد ارزیابی قرار داد و بر اساس رشد روی این محیط ها تست های بیوشیمیایی بعدی مشخص میشود. تست های بیوشیمیایی متداول برای گرم منفی ها تست های تولید ایندول، متیل رد، VP، مصرف سیترات، اوره آز، خصوصیت اکسیداتیو/فرمنتاتیو، تست حرکت و رشد روی محیط TSI هستند.
البته در اینجا هدف توضیح روش های شناسایی باکتری ها نیست و صرفا روش های شیمیایی مورد استفاده در شناسایی باکتری ها نام برده شدند. لازم به ذکر است که برخی از کیت های تجاری مانند تست API نیز برای شناسایی باکتری ها ارائه شده اند که گاهی جایگزین تست های افتراقی و گاهی مکمل این تست ها در مراحل شناسایی باکتری های آلوده کننده فرآورده های دارویی هستند.
شناسایی مولکولی میکروارگانیسم‌ها
روش شناسایی مولکولی شامل کشت اولیه میکروارگانیسم و استخراج DNA است. پس از استخراج DNA میتوانید با تکثیر بخش 16s rRNA در باکتری ها و 26S و یا 18s در مخمرها و قارچ ها و تعیین توالی بخش تکثیر شده سویه جداسازی شده را به دقت شناسایی نمود. البته قبل از شناسایی مولکولی بایستی تست های اولیه بیوشیمیایی انجام شده و عمل استخراج و PCR در یک کلنی خالص انجام شود.
البته امکان طراحی پرایمر های اختصاصی برای سویه های مشخصی از باکتری ها نیز وجود دارد و در این حالت با انجام PCR سویه مورد نظر شناسایی خواهد شد. اگرچه این روش برای سویه های محدودی امکان پیاده سازی دارد اما با توجه به اینکه سویه های غالب آلوده کننده در فرآورده های دارویی تا حدودی مشخص هستند این روش می تواند سرعت شناسایی را تا حد قابل توجهی افزایش دهد.
داروهای استریل و غیراستریل
بدون شک تمامی فرآورده های دارویی و آرایشی و بهداشتی استریل نیستند. داروهای استریل داروهایی هستند که به هیچ عنوان نباید دارای بار میکروبی باشند و تست های میکروبی در این داروها با سختگیرانه ترین حالت انجام میشود. اما فراورده های غیر استریل، بایستی عاری از میکروارگانیسم های پاتوژن و بیماری زا باشند، اما وجود مقدار مشخصی از میکروارگانیسم های غیر پاتوژن برای این محصولات مشکلی ایجاد نخواهد کرد.
تست حد میکروبی یا microbial limit test (MLT) نشان دهنده میزان و نوع میکروارگانیسم زنده ای است که در یک دارو یا فراورده آرایشی و بهداشتی غیر استریل میتواند وجود داشته باشد. این تست میتواند برای مواد اولیه و یا محصول نهایی مورد ارزیابی انجام شود.
